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Elisa試劑盒新手操作完整步驟
瀏覽次數:205發布日期:2022-07-25
  一.實驗目的
 
  酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA)是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques)的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術,ELISA過程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被,加待測抗體(抗原), 再加相應酶標記抗體(抗原),天生抗原(抗體)--待測抗體(抗原)--酶標記抗體的復合物,再與該酶的底物反應天生有色產物。借助分光光度計的光吸收計算抗體(抗原)的量。待測抗體(抗原)的定量與有色產天生正比。
 
  二.實驗原理
 
  用于免疫酶技術的酶有很多,如過氧化物酶,堿性磷酸酯酶,β-D-半乳糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,AchE,6-磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶,堿性磷酸酯酶等,其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應,在呈色后須立即測定,否則空氣中的氧化作用使顏色加深,無法正確地定量。
 
  辣根過氧化物酶(HRP)是一種糖蛋白,每個分子含有一個氯化血紅素(protonhemin)區作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的最大吸收峰是403nm,HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm,所以酶的濃度和純度計算式是(已知HRP的A(1cm 403nm 1%)=25,式中1%指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以,酶濃度以 mg/ml 計算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP純度(RZ)=A403nm/A275nm純度RZ(Reinheit Zahl)值越大說明酶內所含雜質越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右,最高
 
  ELISA的主要常用類型及步驟
 
  1. 間接法測抗體
 
  間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體(二抗)以檢測與固相抗原結合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:
 
  1)將特異性抗原與固相載體聯結,形成固相抗原,洗滌除去未結合的抗原及雜質。
 
  2)加稀釋的樣本,保溫反應。樣本中的特異抗體與固相抗原結合,形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
 
  3)加酶標抗抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗抗體結合,從而間接地標記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關。
 
  4)加底物顯色。
 
  2.雙抗體夾心法測抗原
 
  雙抗體夾心法是檢測抗原的方法,操作步驟如下:
 
  1)將特異性抗體與固相載體聯結,形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
 
  2)加受檢樣本,保溫反應。樣本中的抗原與固相抗體結合,形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。
 
  3)加酶標抗體,保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關。
 
  4)加底物顯色。
 
  3.雙抗原夾心法測抗體
 
  反應原理和模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物,以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體
 
  4.競爭法測抗原
 
  小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,因此不能用雙抗體夾心法進行測定,可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多,結合在固相上的酶標抗原愈少,最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。
 
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